MICROSCOPÍA DE POLARIZACIÓN

¿QUÉ ES LA POLARIZACIÓN DE LA LUZ?

La luz tiene naturaleza dual onda-partícula, cuando se comporta como una onda oscila en diferentes direcciones donde los componentes Eléctrico y Magnético son perpendiculares. La polarización de la luz se define como la orientación preferencial de una onda electromagnética, mediante uso de un polarizador, dispositivo que solo permite el paso del componente eléctrico de la onda electromagnética. 

MICROSCOPÍA DE LA LUZ POLARIZADA 

El microscopio de luz polarizada se utiliza para analizar la anisotropía de las propiedades ópticas de una muestra, como la refracción y la absorción. La anisotropía óptica es una consecuencia del orden molecular, que puede hacer que las propiedades ópticas dependan de la polarización de la luz. La microscopía de luz polarizada aprovecha esta dependencia y proporciona una herramienta sensible para analizar la alineación de enlaces moleculares o formas estructurales finas en materiales naturales y artificiales.

La mayoría de las estructuras biológicas exhiben cierto grado de anisotropía que es característico de su arquitectura molecular, como las membranas y las matrices de filamentos. Una membrana se modela como una hoja de moléculas lipídicas en las que se incrustan proteínas, todas las cuales mantienen cierto grado de orientación con respecto al plano de la membrana. Por lo tanto, los tejidos, células y orgánulos que incluyen estructuras membranosas extensas, como mitocondrias y fotorreceptores, pueden exhibir birrefringencia (anisotropía de refracción) y diatenuación (anisotropía de atenuación) que son características de su composición y arquitectura molecular (1).

MICROSCOPÍA DE POLARIZACÍON  DE FLUORESCENCIA  

La propiedad de polarización de la fluorescencia fue descubierta por el físico francés Perrin en 1926. Bajo excitación, las moléculas fluorescentes absorben y emiten fotones en forma de radiación dipolo. Este fenómeno se llama polarización cromóforo.  Los principios físicos fundamentales de la polarización de la fluorescencia se han investigado intensamente. 

La microscopía de polarización de fluorescencia (FPM), también llamada microscopía de polarización basada en etiquetas, puede medir simultáneamente la intensidad del dipolo y la información de orientación para estudiar la organización de la estructura biológica subyacente. Por ejemplo, FPM se usa para monitorear el proceso de activación dinámica de proteínas de membrana. 

Fig. 1. Principio analítico de la orientación del dipolo fluorescente y la configuración óptica. (A) En un sistema de coordenadas esféricas, un ángulo azimutal / y un ángulo normal h parametrizan la orientación del momento dipolar. Dos flechas rojas representan la orientación 3D y 2D, respectivamente. (B) La intensidad del fotón es la más grande ya que la orientación del dipolo es paralela a la dirección de la luz de excitación polarizada y la más débil ya que ambas direcciones son perpendiculares entre sí. (C) Los componentes de CA de la intensidad de emisión de dos dipolos se puede agregar de acuerdo con los principios de la adición de vectores. Dos flechas negras y una flecha roja se refieren a dos dipolos y su dipolo eficiente. / i y Mi representan la orientación y el fotón máximo de un solo dipolo, respectivamente. (D) Los perfiles de emisión de dos dipolos (curvas negras discontinuas) y la curva de emisión de su dipolo de conjunto equivalente (línea roja continua) bajo excitación de polarización. (E) Configuración óptica típica para excitación de polarización (PE) y detección de polarización (PD) basada en microscopio de campo amplio. Los moduladores de la excitación de polarización y la detección de polarización corresponden a los óvalos violeta y marrón de la Fig. 1G-I. (F) Esquema óptico clásico de anisotropía de fluorescencia con una excitación de polarización lineal y dos direcciones de observación que son paralelas y perpendiculares al ángulo de excitación de polarización respectivamente. (G) Configuración de detección de polarización con iluminación de polarización isotrópica para analizar el dipolo de emisión. (H) Esquema de excitación de polarización para acceder al dipolo de absorción. (I) Excitación de polarización simultánea y detección de polarización para determinar el dipolo de emisión y absorción. (J) Análisis del patrón de difracción desenfocado para resolver el dipolo de emisión. (Para interpretar las referencias al color en la leyenda de esta figura, los lectores pueden consultar la versión web de este artículo).

El principio central de FPM es extraer la orientación del momento dipolar y la orientación de mayor resolución accede a una observación más detallada (2).

Aplicaciones biológicas de Microscopía de polarización de fluorescencia (FPM)

FPM detecta tanto la información de fluorescencia como de orientación, que es esencial para una multitud de observaciones biológicas y una mayor comprensión de las funciones y procesos celulares. Superresolution FPM se ha desarrollado recientemente para llevar el FPM limitado por difracción convencional a una escala completamente nueva, de modo que el conjunto del número de dipolos se puede reducir y la orientación se puede detectar. Se conocen dos categorías de aplicaciones biológicas: interacción cromóforo-molécula objetivo y organización molecular.

Interacción cromóforo molécula-objetivo

En las ciencias de la vida, la proteína fluorescente y el colorante químico son los cromóforos más utilizados. Las imágenes FPM pueden revelar la interacción de polarización entre el cromóforo y la molécula objetivo. Para crear un enlazador rígido entre la proteína de fluorescencia verde (GFP) y la septina, una parte de la hélice a del extremo N de la GFP truncada se puede fusionar a otra parte de la hélice a del CDC3 truncado del extremo C, para formar una completa -Hélice con suficiente rigidez para la obtención de imágenes PFM.

 

Fig. 2. Caracterización de la molécula cromóforo-objetivo. (A) Diagrama del cromóforo (óvalo rosa) que se une a la molécula objetivo (varilla gris poco profunda). (B) La formación de imágenes de orientación de la estructura de reloj de arena con las construcciones Cdc12-conGFP3 y Cdc12-conGFP4 fusionadas en septin, que exhibe una relación de orientación ortogonal de las dos construcciones. (C) La imagen polar-dSTORM de fibra de actina marcada con Alexa Fluor 488. La apertura angular / es pseudocoloreada. (D) Diagrama esquemático del modo de unión de los tintes bis-intercaladores, intercaladores y tintes de unión de surcos. (E) Imagen de polarización fluorescente del ADN del fago lambda teñido con TOTO-1. (F) Imágenes de ADN probadas intercalando el colorante SYTOX Orange. (G) Interacción in vitro entre el ADN y el colorante unido a surcos SiRHoechst. (H) La flexión local (marcada con una punta de flecha) de la hebra de ADN, sondada por YOYO-1 bis-intercalante, se detecta mediante análisis de polarización.

Organización molecular

Las imágenes FPM podrían usarse para estudiar el comportamiento de la estructura y dinámica de la proteína objetivo. La medición de la orientación dipolar de una sola molécula proporciona a los biólogos una visión incomparable de los sistemas poliméricos como la agregación de macromoléculas, orden de filamentos biológicos (citoesqueleto y fibra de ADN) y dinámica de partículas individuales, donde la FPM puede proporcionar una mejor visión de conjunto. A través del análisis de anisotropía de fluorescencia, FPM revela una disposición paralela de nucleoporina humana Nup133-Nup107 y nucleoporina de levadura Nic96 al plano de la envoltura nuclear. Esta observación apoya el modelo de "anillo de cabeza a cola" según el cual los subcomplejos en forma de Y forman un anillo octamérico a través de la interacción entre el extremo y los brazos cortos de los subcomplejos (Fig. 3A).

 

Fig. 3. Organización estructural observada con FPM. (A) Ambos ejes largos (marcados por u) de la levadura Nic96 y Nup133-Nup107 humanos se orientan aproximadamente perpendiculares al eje nucleocitoplasmático (marcado por N), que sostiene la disposición de anillos planos de cabeza a cola formados por los subcomplejos en forma de Y. (B) Dinámica estructural de septin durante la división de la levadura de estructura de reloj de arena a estructura de doble anillo. (C) En la formación de imágenes del anillo de actina marcado con faloidina en los axones de las neuronas, pSIM revela la organización lado a lado de los filamentos cortos de actina para formar la estructura del anillo de actina. (D) El motor de miosina gira ~ 90 cada paso mientras camina sobre el filamento de actina. Dos óvalos y dos cintas expresan la miosina V e indican la cabeza y el cuello, respectivamente. Las orientaciones de los dos dominios están marcadas con una línea roja y una línea azul, respectivamente. El recuadro es el histograma de la rotación promedio con un pico en 87 (n = 320). (E) Los intercaladores perpendiculares e inclinados ocurren en la transición y están flanqueados por B-DNA y S-DNA, respectivamente. (F) Se presentan imágenes de polarización de partículas SERS en macrófagos vivos y la dirección de la flecha representa el azimut de las partículas SERS. (G) La trayectoria de movimiento y la información de rotación de partícula SERS única. 

REFERENCIAS

1.         Galbraith C, Stemmer A, Davis I, Mehta SB, Shribak M, Oldenbourg R. Journal of Optics Special issue on High Resolution Optical Imaging. 2013;1-22.

2.         Chen L, Chen X, Yang X, He C, Wang M, Xi P, et al. Advances of super-resolution fluorescence polarization microscopy and its applications in life sciences. Computational and Structural Biotechnology Journal [Internet]. 2020;18:2209-16. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j.csbj.2020.06.038