miércoles, 18 de agosto de 2021

MICROSCOPÍA DE POLARIZACIÓN

¿QUÉ ES LA POLARIZACIÓN DE LA LUZ?

La luz tiene naturaleza dual onda-partícula, cuando se comporta como una onda oscila en diferentes direcciones donde los componentes Eléctrico y Magnético son perpendiculares. La polarización de la luz se define como la orientación preferencial de una onda electromagnética, mediante uso de un polarizador, dispositivo que solo permite el paso del componente eléctrico de la onda electromagnética. 

MICROSCOPÍA DE LA LUZ POLARIZADA 

El microscopio de luz polarizada se utiliza para analizar la anisotropía de las propiedades ópticas de una muestra, como la refracción y la absorción. La anisotropía óptica es una consecuencia del orden molecular, que puede hacer que las propiedades ópticas dependan de la polarización de la luz. La microscopía de luz polarizada aprovecha esta dependencia y proporciona una herramienta sensible para analizar la alineación de enlaces moleculares o formas estructurales finas en materiales naturales y artificiales.

La mayoría de las estructuras biológicas exhiben cierto grado de anisotropía que es característico de su arquitectura molecular, como las membranas y las matrices de filamentos. Una membrana se modela como una hoja de moléculas lipídicas en las que se incrustan proteínas, todas las cuales mantienen cierto grado de orientación con respecto al plano de la membrana. Por lo tanto, los tejidos, células y orgánulos que incluyen estructuras membranosas extensas, como mitocondrias y fotorreceptores, pueden exhibir birrefringencia (anisotropía de refracción) y diatenuación (anisotropía de atenuación) que son características de su composición y arquitectura molecular (1).

MICROSCOPÍA DE POLARIZACÍON  DE FLUORESCENCIA  

La propiedad de polarización de la fluorescencia fue descubierta por el físico francés Perrin en 1926. Bajo excitación, las moléculas fluorescentes absorben y emiten fotones en forma de radiación dipolo. Este fenómeno se llama polarización cromóforo.  Los principios físicos fundamentales de la polarización de la fluorescencia se han investigado intensamente. 

La microscopía de polarización de fluorescencia (FPM), también llamada microscopía de polarización basada en etiquetas, puede medir simultáneamente la intensidad del dipolo y la información de orientación para estudiar la organización de la estructura biológica subyacente. Por ejemplo, FPM se usa para monitorear el proceso de activación dinámica de proteínas de membrana. 

Fig. 1. Principio analítico de la orientación del dipolo fluorescente y la configuración óptica. (A) En un sistema de coordenadas esféricas, un ángulo azimutal / y un ángulo normal h parametrizan la orientación del momento dipolar. Dos flechas rojas representan la orientación 3D y 2D, respectivamente. (B) La intensidad del fotón es la más grande ya que la orientación del dipolo es paralela a la dirección de la luz de excitación polarizada y la más débil ya que ambas direcciones son perpendiculares entre sí. (C) Los componentes de CA de la intensidad de emisión de dos dipolos se puede agregar de acuerdo con los principios de la adición de vectores. Dos flechas negras y una flecha roja se refieren a dos dipolos y su dipolo eficiente. / i y Mi representan la orientación y el fotón máximo de un solo dipolo, respectivamente. (D) Los perfiles de emisión de dos dipolos (curvas negras discontinuas) y la curva de emisión de su dipolo de conjunto equivalente (línea roja continua) bajo excitación de polarización. (E) Configuración óptica típica para excitación de polarización (PE) y detección de polarización (PD) basada en microscopio de campo amplio. Los moduladores de la excitación de polarización y la detección de polarización corresponden a los óvalos violeta y marrón de la Fig. 1G-I. (F) Esquema óptico clásico de anisotropía de fluorescencia con una excitación de polarización lineal y dos direcciones de observación que son paralelas y perpendiculares al ángulo de excitación de polarización respectivamente. (G) Configuración de detección de polarización con iluminación de polarización isotrópica para analizar el dipolo de emisión. (H) Esquema de excitación de polarización para acceder al dipolo de absorción. (I) Excitación de polarización simultánea y detección de polarización para determinar el dipolo de emisión y absorción. (J) Análisis del patrón de difracción desenfocado para resolver el dipolo de emisión. (Para interpretar las referencias al color en la leyenda de esta figura, los lectores pueden consultar la versión web de este artículo).

El principio central de FPM es extraer la orientación del momento dipolar y la orientación de mayor resolución accede a una observación más detallada (2).

Aplicaciones biológicas de Microscopía de polarización de fluorescencia (FPM)

FPM detecta tanto la información de fluorescencia como de orientación, que es esencial para una multitud de observaciones biológicas y una mayor comprensión de las funciones y procesos celulares. Superresolution FPM se ha desarrollado recientemente para llevar el FPM limitado por difracción convencional a una escala completamente nueva, de modo que el conjunto del número de dipolos se puede reducir y la orientación se puede detectar. Se conocen dos categorías de aplicaciones biológicas: interacción cromóforo-molécula objetivo y organización molecular.

Interacción cromóforo molécula-objetivo

En las ciencias de la vida, la proteína fluorescente y el colorante químico son los cromóforos más utilizados. Las imágenes FPM pueden revelar la interacción de polarización entre el cromóforo y la molécula objetivo. Para crear un enlazador rígido entre la proteína de fluorescencia verde (GFP) y la septina, una parte de la hélice a del extremo N de la GFP truncada se puede fusionar a otra parte de la hélice a del CDC3 truncado del extremo C, para formar una completa -Hélice con suficiente rigidez para la obtención de imágenes PFM.


 

Fig. 2. Caracterización de la molécula cromóforo-objetivo. (A) Diagrama del cromóforo (óvalo rosa) que se une a la molécula objetivo (varilla gris poco profunda). (B) La formación de imágenes de orientación de la estructura de reloj de arena con las construcciones Cdc12-conGFP3 y Cdc12-conGFP4 fusionadas en septin, que exhibe una relación de orientación ortogonal de las dos construcciones. (C) La imagen polar-dSTORM de fibra de actina marcada con Alexa Fluor 488. La apertura angular / es pseudocoloreada. (D) Diagrama esquemático del modo de unión de los tintes bis-intercaladores, intercaladores y tintes de unión de surcos. (E) Imagen de polarización fluorescente del ADN del fago lambda teñido con TOTO-1. (F) Imágenes de ADN probadas intercalando el colorante SYTOX Orange. (G) Interacción in vitro entre el ADN y el colorante unido a surcos SiRHoechst. (H) La flexión local (marcada con una punta de flecha) de la hebra de ADN, sondada por YOYO-1 bis-intercalante, se detecta mediante análisis de polarización.

Organización molecular

Las imágenes FPM podrían usarse para estudiar el comportamiento de la estructura y dinámica de la proteína objetivo. La medición de la orientación dipolar de una sola molécula proporciona a los biólogos una visión incomparable de los sistemas poliméricos como la agregación de macromoléculas, orden de filamentos biológicos (citoesqueleto y fibra de ADN) y dinámica de partículas individuales, donde la FPM puede proporcionar una mejor visión de conjunto. A través del análisis de anisotropía de fluorescencia, FPM revela una disposición paralela de nucleoporina humana Nup133-Nup107 y nucleoporina de levadura Nic96 al plano de la envoltura nuclear. Esta observación apoya el modelo de "anillo de cabeza a cola" según el cual los subcomplejos en forma de Y forman un anillo octamérico a través de la interacción entre el extremo y los brazos cortos de los subcomplejos (Fig. 3A).

 

Fig. 3. Organización estructural observada con FPM. (A) Ambos ejes largos (marcados por u) de la levadura Nic96 y Nup133-Nup107 humanos se orientan aproximadamente perpendiculares al eje nucleocitoplasmático (marcado por N), que sostiene la disposición de anillos planos de cabeza a cola formados por los subcomplejos en forma de Y. (B) Dinámica estructural de septin durante la división de la levadura de estructura de reloj de arena a estructura de doble anillo. (C) En la formación de imágenes del anillo de actina marcado con faloidina en los axones de las neuronas, pSIM revela la organización lado a lado de los filamentos cortos de actina para formar la estructura del anillo de actina. (D) El motor de miosina gira ~ 90 cada paso mientras camina sobre el filamento de actina. Dos óvalos y dos cintas expresan la miosina V e indican la cabeza y el cuello, respectivamente. Las orientaciones de los dos dominios están marcadas con una línea roja y una línea azul, respectivamente. El recuadro es el histograma de la rotación promedio con un pico en 87 (n = 320). (E) Los intercaladores perpendiculares e inclinados ocurren en la transición y están flanqueados por B-DNA y S-DNA, respectivamente. (F) Se presentan imágenes de polarización de partículas SERS en macrófagos vivos y la dirección de la flecha representa el azimut de las partículas SERS. (G) La trayectoria de movimiento y la información de rotación de partícula SERS única. 

REFERENCIAS

1.         Galbraith C, Stemmer A, Davis I, Mehta SB, Shribak M, Oldenbourg R. Journal of Optics Special issue on High Resolution Optical Imaging. 2013;1-22.

2.         Chen L, Chen X, Yang X, He C, Wang M, Xi P, et al. Advances of super-resolution fluorescence polarization microscopy and its applications in life sciences. Computational and Structural Biotechnology Journal [Internet]. 2020;18:2209-16. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j.csbj.2020.06.038

viernes, 6 de agosto de 2021

Contaminacion de suelos por plomo

¿QUE ES EL PLOMO?



El plomo es un elemento químico que no es esencial para la salud humana, es un metal pesado que es más denso que la mayoría de los elementos metálicos, suave y maleable con punto de fusión relativamente bajo (327.5 °C)

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fig. 1. Plomo elemental en sus diferentes presentaciones 

El plomo se ha utilizado de diversas formas a lo largo de la historia. Actualmente se utiliza para baterías de almacenamiento de plomo-ácido, con fines de construcción, para revestimiento de cables, blindaje contra radiación y en aleaciones. En forma de polvo, se utiliza en pinturas, pigmentos, pastas, vidrio, esmaltes y cerámicas funcionales 1.

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La exposición al plomo en los seres humanos se produce principalmente a través de alimentos y bebidas, incluidos los alimentos almacenados en latas soldadas con plomo y cerámica vidriada con plomo. La ingesta diaria actual en los países industrializados está en el rango de 8-282 μg, con una ingesta diaria promedio inferior a 100 μg. 

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fig. 2. Exposición humana a compuestos de plomo

Al ser un metal tóxico, el plomo afecta a varios sistemas de órganos del cuerpo, los sistemas nerviosos hematopoyético, cardiovascular, central y periférico. Los bebés y los niños son más vulnerables a la toxicidad por plomo, produce encefalopatía en niños con exposición aguda al plomo. 

Los problemas asociados con la exposición al plomo en humanos se han vuelto menos severos durante las últimas décadas debido a la eliminación de la gasolina con plomo y un mejor control ambiental y ocupacional. Evitar la fuente de exposición y la terapia de quelación son adecuadas para el manejo del envenenamiento por plomo

¿COMO SE INCORPORA EL PLOMO A CUERPOS DE SUELO? 

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EN FORMA INORGÁNICO, PLOMO ELEMENTAL 

Una de las formas de incorporación a cuerpos de suelo es en su forma inorgánica. El plomo es el material principal utilizado para la producción de municiones, debido a su alta gravedad específica, trabajabilidad y facilidad para fundirse. Las municiones (balas, perdigones) se componen principalmente de Pb (90-99% en peso). Este plomo depositado en el suelo se oxida a sus formas móviles como Pb2+ y Pb4+ y pueden ser absorbidos por la raíz de las plantas y los macroorganismos del suelo 

Se estima que existen 100,000 campos de tiro en todo el mundo, donde hasta 72,600 toneladas de Pb de municiones se esparcen en el suelo cada año (Xifra Olivé, 2006; Perroy et al., 2014)

Diagrama, Esquemático

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Fig. 3. comportamiento ecotoxicológico y químico del Pb en el suelo (PAHs: hidrocarburos aromáticos policíclicos) 2

EN FORMA ORGÁNICO, COMO COMPUESTO TETRAETILO DE PLOMO C8H20Pb

La exposición humana al plomo (Pb) es un creciente problema de salud pública mundial. Debido al grave riesgo para la salud, la comunidad internacional, liderada por el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), han estado apoyando activamente la eliminación mundial de la pintura a base de plomo para 2020 3.   

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Fig. 4. Principales fuentes de contaminación de suelo por compuestos orgánico de plomo 4.

El suelo puede contaminarse con polvo de pintura con plomo y astillas de pintura de actividades como renovación, repintado o demolición de viviendas y otras estructuras pintadas, o por la combustión histórica de gasolina con plomo. El suelo contaminado es uno de los principales contribuyentes a los niveles elevados de plomo en sangre en los niños.

¿EXISTEN CASOS DE ENVENAMIENTO POR PLOMO?

En el 2002 Gordon y colaboradores, en un estudio realizado reportaron 3 casos de pacientes luego de exposición al plomo.

CASO 1: Un pintor y decorador de 40 años se presentó con un historial de 6 semanas de malestar, calambres abdominales, náuseas, artralgias y deterioro mental leve. Anteriormente había estado trabajando en un edificio georgiano en Bath usando un soplete industrial y una lijadora para quitar la pintura. Dos de los tres pisos tenían paredes con paneles de madera; todos tenían de 8 a 10 capas de pintura y algunos eran claramente muy viejos. Aunque había adquirido un respirador nuevo, no lo usaba cuando otros trabajadores quemaban o lijaban en otras habitaciones del mismo piso, y durante los descansos comía, bebía y fumaba cigarrillos en el mismo edificio. No se realizaron mediciones de las concentraciones de plomo atmosférico.

CASO 2: Un decorador autónomo de 51 años se presentó a su médico de cabecera con un historial de 4 semanas de náuseas, estreñimiento, dolores de cabeza, mareos intermitentes y parestesias y debilidad en las manos. Dijo que había experimentado una exposición prolongada a la pintura con plomo mientras redecoraba una casa de la regencia tardía (alrededor de 1820) en Bath. Su plomo en sangre inicial fue de 4,04 µmol l -1 (84,2 µg 100 ml -1). no se detectaron anomalías en el examen físico. 

CASO 3: Un hombre de 22 años se presentó con un historial de 2 semanas de letargo, malestar general, dolores de cabeza, náuseas y dolor abdominal tipo cólico. Había estado trabajando en el mismo sitio que el caso 1, aunque de forma intermitente durante 12 semanas. Su nivel de plomo en sangre era de 4,09 µmol l -1 (85,2 µg 100 ml -1). En el examen se observó anemia, pero por lo demás estaba bien y no presentaba ningún deterioro neurológico o intelectual. La investigación mostró: Hb 9,7 g 100 ml -1 con policromasia moderada y punteado basófilo de los glóbulos rojos. por lo demás, su recuento sanguíneo estaba dentro de los límites normales, al igual que sus electrolitos y pruebas de función hepática 5

¿QUÉ MÉTODOS NORMALIZADOS EXISTEN PARA CUANTIFICAR PLOMO SUELO?

En los Estándares de Calidad Ambiental (ECA) dada a través del DECRETO SUPREMO N°002-2013-MINAM 6, establece dos métodos de ensayo normalizados de la EPA (Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos): METHOD 3050-B y METHOD 3051

METHOD 3050-B (ACID DIGESTION OF SEDIMENTS, SLUDGES, AND SOILS)

Este método ha sido escrito para proporcionar dos procedimientos de digestión separados, uno para la preparación de sedimentos, lodos y muestras de suelo para análisis por espectrometría de absorción atómica de llama (FLAA) o espectrometría de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES) y otro para la preparación de sedimentos, lodos y muestras de suelo para el análisis de muestras por Horno de grafito AA (GFAA) o espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Los extractos de estos dos procedimientos no son intercambiables y solo deben usarse con las determinaciones analíticas descritas en esta sección. Las muestras preparadas mediante este método pueden ser analizadas por ICPAES o GFAA para todos los metales enumerados siempre que los límites de detección sean adecuados para el uso final requerido de los datos. Se pueden utilizar técnicas determinativas alternativas si son científicamente válidas y se pueden alcanzar los criterios de CC del método, incluidos los relacionados con las interferencias.

METHOD 3051 (MICROWAVE ASSISTED ACID DIGESTION OF SEDIMENTS, SLUDGES, SOILS, AND OILS)

Este método de extracción por microondas está diseñado para imitar la extracción mediante calentamiento convencional con ácido nítrico (HNO3) o, alternativamente, ácido nítrico y ácido clorhídrico (HCl), de acuerdo con el método EPA 200.2 y el método 3050. Dado que este método no está destinado a lograr la descomposición total de la muestra, es posible que las concentraciones de analito extraído no reflejen el contenido total de la muestra. Este método es aplicable a la extracción / disolución ácida asistida por microondas de sedimentos, lodos, suelos y aceites.

¿COMO DETERMINAR LA TOXICIDAD DEL PLOMO?

En general, la contaminación por metales pesados ​​en los ecosistemas acuáticos es un problema urgente y recurrente para la preservación de la biodiversidad y la salud humana. La contaminación por metales pesados ​​se asocia principalmente a residuos de actividades mineras e industriales, y descargas ambientales de lodos de depuradora doméstica tratados y no tratados. Un gran número de estudios muestran que los metales pesados ​​pueden ejercer efectos toxicológicos en los organismos acuáticos a concentraciones controladas en aguas superficiales con notable presión antropógeno.

El efecto toxicológico de los metales pesados ​​en los organismos acuáticos depende en gran medida de la concentración de exposición, su especiación en condiciones ambientales y su naturaleza, es decir, metales esenciales frente a no esenciales. Por ejemplo, metales esenciales como el zinc o el cadmio son elementos clave para el crecimiento de los organismos vivos. Sin embargo, en grandes dosis, estos metales pueden inhibir el crecimiento, reducir la endocitosis y las tasas de absorción de alimentos y concentrarse en la membrana celular, lo que conduce a la rotura y lisis celular. Por otro lado, los metales no esenciales como el plomo y el mercurio se unen a grupos que contienen tiol y sitios de oxígeno, causan alteraciones en la estructura configuracional de ácidos nucleicos y proteínas e interfieren con la fosforilación oxidativa y el equilibrio osmótico de células y organismos.

La evaluación del riesgo ecotoxicológico de los metales pesados ​​generalmente implica el desarrollo de concentraciones umbral basadas en datos de toxicidad para un número limitado de especies de prueba estándar (es decir, algas, microcrustáceos, peces) y la aplicación de factores de evaluación. Se espera que los factores de evaluación tengan en cuenta las diferencias de sensibilidad entre especies, de modo que el umbral derivado las concentraciones también pueden proteger organismos de ensayo no estándar 7.

ENSAYOS ECOTOXICOLÓGICOS CON ESPECIES ACUATICAS

Prueba de inhibición de la bioluminiscencia de V. fischeri

Se realizan pruebas de Microtox® para evaluar la toxicidad de muestras de suelo después de 5, 15 y 30 min de exposición a la bacteria marina V. fisheri, siguiendo la Prueba Microtox® Basic Solid-Phase Test (BSPT) y utilizando un Analizador Microtox 500. Se prueba 7 ± 0.01 g de suelo como suspensiones preparadas con 35 ml de diluyente de prueba en fase sólida agitado magnéticamente durante 10 min y, diluido a una serie de nueve concentraciones, separado por un factor de dilución de 2. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición de bioluminiscencia después de 30 min de exposición.

Prueba de inmovilización aguda de D. magna

Se realiza una prueba de inmovilización aguda de 48 h de D. magna para probar la toxicidad de los diferentes elutriatos preparados a partir de todas las muestras de suelo. Los elutriados del suelo se preparan agitando una suspensión de suelo / medio ASTM (1: 4 m / v) durante 24 h. Se prueba una serie de diluciones (0, 13, 19, 29, 44, 66 y 100%) de elutriatos del suelo. Después de agitar, los elutriados se dejan reposar durante 12 h y se decanta antes del análisis.

Ensayos de inhibición del crecimiento de algas de agua dulce

La prueba de crecimiento de 72 h de R. subcapitata se realiza en elutriatos preparados de todos los suelos siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente, pero esta vez utilizando el medio Woods Hole MBL, para criar cultivos de esta especie en el laboratorio. La prueba se lleva a cabo siguiendo la directriz de prueba 201 de la OCDE (OCDE, 2011), en microplacas estériles de 24 pocillos, bajo iluminación fluorescente blanca fría continua (temperatura 21 ° ± 2 ° C). Se ensaya una serie de diluciones (0, 13, 19, 29, 44, 66 y 100%) de cada elutrido. Para cada dilución se preparan 4 réplicas (pocillos) que contiene 900 µl de elutriado y 100 µl de inóculo de algas preparado para comenzar con una densidad celular inicial de 10-4 células / ml en todos los pocillos. Se preparan CTL (2 por placa) con medio ASTM. Al final del tiempo de exposición (72 h), se determina la tasa de crecimiento de algas (expresada como un cambio en el número de células de algas / día) después del recuento de células microscópicas en una cámara de Neubauer. Se preparan cuatro réplicas para cada dilución de elutrido y el control (CTL con medio ASTM solamente) con cinco neonatos de 24 horas y 25 ml cada uno. No se proporcionó comida durante el período de prueba. Después de períodos de exposición de 24 y 48 h, se comprueba la inmovilización de los dáfnidos. Los resultados se expresan como porcentajes de inmovilización en la concentración del 100% de cada elutrido, ya que estos fueron los valores utilizados para el cálculo del riesgo.

ENSAYOS ECOTOXICOLÓGICOS CON ESPECIES TERRESTRES: E. andrei

Prueba de reproducción

Se realiza una prueba de reproducción con E. andrei (56 días) para evaluar la toxicidad del suelo siguiendo la directriz estándar OCDE 222 (OCDE, 2004a, 2004b). Los organismos se obtienen de cultivos de laboratorio criados en grandes contenedores, bajo condiciones controladas: temperatura (20 ± 2 ° C) y fotoperiodo (16 hL: 8 hD). Las lombrices de tierra se suelen mantener en un sustrato compuesto por turba, estiércol de caballo seco y descompuesto y agua, siendo periódicamente humedecido, monitoreado y renovado (Gavina et al., 2016). Las pruebas se realizan en envases de plástico con 500 g (secos peso, ps) de cada suelo con contenido de agua ajustado al 40% de su WHC máxima. Se agregan diez lombrices de tierra adultas cliteladas (peso entre 300 y 600 mg) a cada réplica (cuatro réplicas por suelo), y permanecieron allí durante 28 días. Se añade cada semana estiércol de caballo seco y desnutrido (5 g) durante el período de prueba, así como agua desionizada, cuando fue necesario, para mantener el contenido de agua del suelo. Después de 28 días de exposición, los adultos se extrajeron suavemente de los recipientes de prueba clasificándolos a mano, contados y pesados. Al final del ensayo de reproducción (56 días de exposición), se saca los juveniles de los contenedores. Los contenedores se colocan en un baño de agua a 60 ° C y se contaron los juveniles a medida que emergían a la superficie del suelo2.

 REFERENCIAS 

1.        Lem S. Chapter 13 [Internet]. His Master’s Voice. Elsevier Inc.; 2020. 181-191 p. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-805378-2.00014-0

2.        Rodríguez-Seijo A, Cachada A, Gavina A, Duarte AC, Vega FA, Andrade ML, et al. Lead and PAHs contamination of an old shooting range: A case study with a holistic approach. Science of the Total Environment [Internet]. 2017;575:367-77. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.scitotenv.2016.10.018

3.        O’Connor D, Hou D, Ye J, Zhang Y, Ok YS, Song Y, et al. Lead-based paint remains a major public health concern: A critical review of global production, trade, use, exposure, health risk, and implications. Environment International [Internet]. 2018;121(July):85-101. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j.envint.2018.08.052

4.        Tighe M, Beidinger H, Knaub C, Sisk M, Peaslee GF, Lieberman M. Risky bismuth: Distinguishing between lead contamination sources in soils. Chemosphere [Internet]. 2019;234:297-301. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2019.06.077

5.        Gordon JN, Taylor A, Bennett PN. Lead poisoning: Case studies. British Journal of Clinical Pharmacology. 2002;53(5):451-8.

6.        El Peruano D. Decreto Supremo Nro. 002-2013-MINAM «Aprueban Estándares de Calidad Ambiental (ECA) para Suelo». 2013. 2013;491497-500.

7.        Vilas–Boas JA, Cardoso SJ, Senra MVX, Rico A, Dias RJP. Ciliates as model organisms for the ecotoxicological risk assessment of heavy metals: A meta–analysis. Ecotoxicology and Environmental Safety [Internet]. 2020;199(April):110669. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2020.110669

  

 



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